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En la realidad alternativa designada como la Tierra-65, Gwen Stacy de la Escuela Midtown High de 15 años , es mordida por una araña radioactiva y se convierte en una superheroína llamada Spider-Woman. Ella es también un miembro de una banda junto a Mary Jane Watson, Betty Brant y Gloria Grant, llamadas simplemente las Mary Janes. Poco después de que ella comience a combatir el crimen, uno de sus compañeros de clase, Peter Parker intenta vengarse de los que lo han intimidado en Midtown High, convirtiéndose en el enemigo inicial del Universo Tierra-65, llamado Lagarto. Gwen lo somete, pero Peter muere hacia el final de la batalla debido a la química que ha utilizado. Spider-Woman es culpada de su muerte, provocando una protesta por su arresto, dirigido por J. Jonah Jameson. Su padre, George Stacy, jefe de policía de la policía de Nueva York, comienza a buscarla junto con el capitán Frank Castle y la detective Jean DeWolff. Mientras las Mary Janes intentan actuar en un concierto, un asesino se envía después del padre de Gwen Stacy, que está en la audiencia. Como Spider-Woman, ella derrota con éxito al asesino. Durante la batalla, el Capitán Stacy sostiene a Spider-Woman a puntar con su pistola, y Gwen Stacy se quita la máscara para revelar quién es ella a su padre. Sorprendido al conocer la identidad de Spider-Woman, él le dice que corra antes de cambiar de opinión.
En la serie de cómics Spider-Gwen, ella lucha contra varias versiones alternativas de los villanos de Spider-Man, como Buitre, Kraven el Cazador y Harry Osborn como el Duende Verde. En forma más recurrente, trata con Matt Murdock como Kingpin que intenta corromper a Spider-Gwen en el estilo de vida del crimen junto con Frank Castle que la persigue como vigilante. A pesar de sus enemigos, también trata con aliados heroicos en la Tierra-65, como el Capitán América (Samantha Wilson), Reed Richards y Peggy Carter, la líder de S.H.I.E.L.D.
